CARNET DE NOTES pratiques (essais
réalisés)
Ce carnet de
notes constitue un simple compte-rendu de mes essais et erreurs, avec les résultats obtenus et les
commentaires éventuels. Nous nous attachons à effectuer des essais de divers colorants afin de tenter
de sortir des sentiers habituels et d'ouvrir de nouvelles pistes.
Règle générale pour les photos
au COOLPIX 995, avec mon type d’éclairage : correction de –1,00 d’ouverture en mode macro manuel, afin
d’éviter les photos systématiquement surexposées ; utilisation du retardateur 3 secondes.
Travaux de Mycologie (étude des champignons) |
Travaux de Botanique (étude des pollens) |
Travaux d'Entomologie (étude des insectes) |
Gymnosporangium sabinae
(Dickson) Winter (29/04/2003) : c'est une Urédinale (rouille) !
Téleutospores : 39-46 x 20-22 µ
Fixation très rapide au formol filtré (60 secondes) puis rinçage
Prépa 1 : Rouge Neutre, 60 sec. > excellent
résultat
Prépa 2 : bleu de toluidine, 1 goutte pour 5 gouttes
d'eau, 60 sec. > résultat passable, sans plus, avec empâtements par endroits
Prépa 3 : Rouge Congo SDS, 90 sec. > résultat correct
pour les parois
- Prépa 4 : Crésyl violet dilué à 50 %, 30 sec. > résultat médiocre
Morchella rotunda (Pers. : Fr.)
Boudier (= M. esculenta Pers. ex Sr-Amans), (06/05/2003) ; c'est une Morille ! Spores : 19-22 x 11-12 µ
asques à 8 spores (octosporés) : 312-370 x 17-20 µ ; Pas de fixation préalable !
Prépa 1 : bleu de crésyl selon Clémençon, 60 sec. >
excellents résultats avec asques en bleu clair et spores bien visibles, certaines fixant vivement
le bleu ; on distingue nettement sur certaines spores de fines gouttelettes ( ? ? ?) externes,
agglutinées aux 2 pôles. Pas de métachromasie au niveau de la paroi (mais cela existe-t-il chez les
Ascomycètes ?)
Prépa 2 : bleu coton lactique, 60 sec. puis chauffé
jusqu’au 1er bouillon > résultat moins bon qu’avec le précédent les spores sont très (trop)
vivement colorées en bleu :cyanophilie évidente
Prépa 3 : Rouge Congo SDS, 90 sec. > excellent pour
les asques, quasi nul pour les spores
Prépa 4 :Rouge neutre, 180 sec. > bon résultat avec
filtre bleu : spores correctes et inclusions des asques très visibles
Prépa 5 : Eosine jaunâtre alcoolique 60 sec. + filtre
bleu > bon résultat, mais le moins conseillé parmi les 5 essais
Peziza vesiculosa Bull. ex St-Amans
(04/05/2003)
spores : 20,5-22 x 10,5-12,5 µ
asques à 8 spores (octosporés) : 325-365 x 17-23 µ
Pas de fixation préalable !
Prépa 1 : bleu de méthylène, 30 sec. > excellents
résultats avec asques en bleu clair et spores bien visibles, certaines fixant vivement le bleu
Prépa 2 : bleu d’aniline acétique, 60 sec. > résultat
moins bon qu’avec le précédent, mais les inclusions et le noyau des spores sont bien visibles ; des
vacuoles dans les asques prennent vivement le bleu
Prépa 3 : Rouge Congo SDS, 90 sec. > excellent pour
les asques, quasi nul pour les spores
- Prépa 4 : Crésyl violet dilué à 50 %, 30 sec. > résultat moyen
Prépa 5 : coloration combinée de bleu de méthylène et
de Rouge Congo SDS > excellent résultat de double coloration avec contraste très net et très
agréable à l'oeil
ATTENTION : ne pas oublier que le Rouge Congo précipite
en noir immédiat, dans tout milieu acide ; s’il faut rectifier, ajouter une goutte d’ammoniaque
Mitrula paludosa Fries
(08/05/2003)
spores très nettement cylindriques, à bouts arrondis :
9-13 x 2,5-3 µ ; certaines spores sont septées (cloisonnées) ; elles présentent des inclusions
nombreuses sous forme de gouttelettes.
asques à 8 spores (octosporés) : 105-145 x 8-8,5 µ
Pas de fixation préalable !
Prépa 1 : bleu de méthylène, 180 sec. > les hyphes sont
colorées en bleu clair et les inclusions sporiques sont bien visibles, certaines fixant vivement le
bleu
Prépa 2 : bleu d’aniline acétique, 120 sec. > hyphes et
asques prennent bien le bleu ; les spores sont +/- visibles, certaines se colorant au niveau des
vacuoles
Prépa 3 : Rouge Congo SDS, 120 sec. > excellent pour
les hyphes, quasi nul pour les spores (leur paroi se colore légèrement après 10 minutes)
- Prépa 4 : Crésyl violet dilué à 50 %, 60 sec. > coloration vive et en masse du cytoplasme
des spores ; résultat médiocre au niveau des asques et hyphes
Prépa 5 : bleu de crésyl selon Clémençon, 2 minutes >
excellent résultat pour différencier le contenu du cytoplasme des spores ; résultat médiocre au
niveau des asques et hyphes. Il faut noter que ce colorant est très efficace sur le cytoplasme des
algues filamenteuses, dont j'ai trouvé des débris dans ma préparation, ce qui n'est pas surprenant
puisque ce champignon vit dans des lieux très humides et même dans l'eau.
- Prépa 6 : Eosine jaunâtre 60 sec. > résultat médiocre à nul : ce colorant très efficace
en histologie et cytologie animales ne semble guère présenter d'intérêt en mycologie.
- Prépa 7 : bleu de toluidine dilué à 50 %, 60 sec. > aucune coloration des spores ;
résultat moyen au niveau des asques et hyphes
- Prépa 8 : Rouge neutre, 3 minutes > hyphes et pataphyses +/- colorées ; aucune coloration
des spores et des asques.
Lactarius helvus
(Fr. : Fr.) Fr. (25/08/2003); prélèvement d'un petit fragment de lame et dissociation
Prépa 1 : 1ère observation dans l’eau pure : les
laticifères (hyphes contenant le lait) sont nettement visibles grâce à leur réfringence.
Prépa 2 : coloration à l'encre de Chine durant 1 minute >
les laticifères sont nettement plus visibles > paroi colorée en gris
Prépa 3 : nouvelle préparation et passage à la
sulfovanilline > les laticifères sont colorées en noir opaque
Prépa 4 : nouvelle préparation colorée au rouge Congo
SDS > cystides et basides sont superbement colorées et très visibles
Prépa 5 : nouvelle préparation colorée au réactif de
Melzer > spores 5-6 x 4,5-5 mµ, subglobuleuses, avec l'ornementation amyloïde nettement mise en
évidence
Russula integra
(Linné) Fr. (25/08/2003); prélèvement d'un petit fragment de cuticule et mise en évidence des
incrustations acido résistantes, sur les dermatocystides (voir le modus operandi dans les fiches
techniques de microscopie)
Etape 1 : laisser séjourner le fragment durant 3 à 5
minutes dans la Fuchsine de Ziehl
Etape 2 : rincer rapidement dans la goutte d'eau (cela
a pour résultat de bloquer la coloration)
Etape 3 : rincer durant 10 à 15 secondes dans l'acide
chlorhydrique à 5 % : cela a pour résultat de régresser la coloration générale
Etape 4 : placer le fragment dans une goutte d'eau, et
observer : les incrustations (cristaux d'acide oxalique ?) extérieures à la dermatocystide, sont
nettement colorées en mauve +/- clair !
NB : si vous observez dans l'acide chlorhydrique, la
régression continue et tout se décolore
Russula violeipes
Quélet (25/08/2003); prélèvement d'un petit fragment de cuticule et recherche des dermatocystides
en forme de poils (poils cystidiformes à partie terminale fusiforme allongée, et partie basale une ou
plusieurs fois étranglée > cela ressemble à un spermatozoïde)
Etape 1 : coloration au rouge Congo SDS
Etape 2 : montage à la glycérine gélatinée
NB : nous considérons que le montage à la glycérine
gélatinée constitue une étape importante, car les préparations semi définitives obtenues permettent
de conserver un bon travail durant quelque temps : jusqu'à 2 ou 3 ans !
Cette technique demande du soin au chauffage afin d'éviter l'apparition de bulles qui gâchent la
préparation (voir la fiche technique).
Agaricus campestris
L. : Fr. (25/08/2003); essai d'une série de colorants non utilisés habituellement en mycologie !
Dimension des spores : 7-8 x 5 mµ, de couleur brun chocolat au lait clair
Violet de Gentiane : hyphes et tissus colorés en violet ;
spores peu colorées sauf l’une ou l’autre, un peu mauve ; spores à 1, 2 ou 3 noyaux
Safranine formolée de Semichon : hyphes et tissus colorés en
rouge cerise ; spores peu colorées mais uniformément, en rouge clair orangé ; noyaux très visibles
Vert de méthyle acétique : hyphes et tissus peu colorés en
vert, mais nettement visibles ; spores de couleur naturelle ; noyaux très visibles
Bleu de crésyl alcoolique de Clémençon : hyphes et tissus
rendus complètement opaques par le bleu ; la moitié des spores de couleur naturelle, et les autres
en bleu ciel ; noyaux très visibles
Eosine à 2 % : ensemble uniformément coloré de rose, mais pas
de résultat marquant
Phloxine B alcoolique : hyphes et tissus uniformément colorés
en rose fluo ; la moitié des spores de couleur naturelle, et les autres en rose clair ; noyaux très
visibles
Hemalun de Carrazi : tissus colorés en violet clair ; hyphes
nettement visibles ; spores de couleur naturelle, non colorées ; noyaux très visibles
Carmin d’indigo : pas de coloration, à aucun niveau
Astra blue : hyphes et tissus uniformément colorés en vert
émeraude clair ; la moitié des spores de couleur naturelle, et les autres en vert clair ; noyaux
peu visibles dans ce cas
Vert d’anthracène acétique : ensemble uniformément coloré de
brun clair chair, mais pas de résultat marquant ; les spores semblent plus brunes
Vert d’iode : hyphes et tissus rendus complètement opaques par
le vert ; endospore et exospore bien visibles, contenu cellulaire coloré de vert
Rouge de ruthénium aluné : ensemble uniformément coloré de
brun chair, mais pas de résultat marquant
Rouge Congo au Sodium Dodécyl
Sulfate : coloration superbe, rendant la lecture parfaitement lisible : basides avec
stérigmates, cystides, hyphes, cellules ; la moitié des spores de couleur naturelle, et
les autres en rose rouge (cela est dû à la maturité +/- avancée des spores : les spores bien
mûres ne se colorent pas) ; les noyaux ne sont pas visibles : ce sont les vacuoles ou
les gouttes lipidiques qui sont bien mises en évidence : le meilleur
des colorants d'ensemble !
Hibiscus syriacus Linné (appelé aussi
Ketmie de Syrie) : grains de pollen (22/07/2003)
Forme globuleuse ; dimensions :
120-125 µ de diamètre, avec grosses épines de 18-20 µ de long, à bout nettement arrondi
Fixation et dégraissage préalables avec éthanol à 95° (jusqu’à évaporation de la goutte) !
Le pollen est réuni en un petit tas au centre de la lame (voir modus operandi sur la fiche technique
consacrée aux pollens)
Prépa 1 : bleu coton alcoolique, 2 minutes > aucun
résultat : ce pollen ne prend pas le bleu coton et conserve sa teinte naturelle
Prépa 2 : vert de méthyle, 2 minutes > résultat très
bon
Prépa 3 : bleu de thymol > aucun résultat : pas de
coloration
- Prépa 4 : phloxine B diluée à 50 %, 3 minutes > belle coloration rose-violet
Prépa 5 : vert malachite, 3 minutes > excellent
résultat avec coloration complète de tout le grain, épines comprises
Prépa 6 : réactif de Melzer : essai afin de vérifier si
on peut arriver au même résultat qu’avec les spores des champignons, et mettre en évidence la
réaction amyloïde ou dextrinoïde de l’ornementation > résultat surprenant : tout le grain est
coloré, sauf les épines et l'enveloppe de la spore
Ces grains de pollens sont nettement plus aléatoires à préparer que
ceux de la rose trémière (Rosea alcea) sur lesquels nous avons expérimenté avec succès et avec un
résultat très intéressant, une série de 7 colorants.
La rose trémière : Althaea rosea (Linné) Cav. (= Rosea
altea Linné) : grains de pollen (18/07/2003)
Forme globuleuse ;
dimensions : 110-115 µ de diamètre, avec fines épines de 10 µ de long, nettement acuminées (ou
aculéolées), c'est-à-dire à pointes fines et aiguës.
Fixation et dégraissage préalables avec éthanol
à 95° (jusqu’à évaporation de la goutte) !
Prépa 1 : Safranine formolée de Sémichon, 2 minutes >
excellent résultat, pour une coloration de masse : rouge +/- foncé
Prépa 2 : Phloxine B alcoolique, 2 minutes > résultat
très bon : rose violet
Prépa 3 : Rouge Congo SDS (SDS signifie Sodium Dodécyl
Sulfate ; cette formule a été mise au point par CLEMECON, un mycologue célèbre.) > il colore en
rouge clair et met remarquablement en évidence le revêtement cuticulaire
- Prépa 4 : Vert d'iode, 3 minutes > belle coloration vert tendre
Prépa 5 : Vert de Méthyle, 5 minutes > excellent
résultat : il colore en vert plus nettement émeraude
Prépa 6 : Eosine aqueuse à 2 %, 5 minutes > rouge léger
Prépa 7 : Rouge neutre, 5 minutes > il colore en rose
rouge
Prépa 8 : Fuchsine phéniquée de Ziehl, préparée à base
de fuchsine basique, 2 minutes > elle colore en bleu violet et peut être régressée avec de l’acide
chlorhydrique à 5 %
Datura sp. (Famille des Solanacées
– il existe une espèce sauvage : Datura stramonium Linné) ; il s’agit ici d’un cultivar,
intéressant par la taille très grande de sa fleur et surtout par une quantité incroyable de pollen.
grains de pollen (10/08/2003)
Forme globuleuse ; dimensions : 40-46
µm de diamètre, avec une ornementation finement ponctuée et disposée le long de lignes serrées,
semblables aux méridiens terrestres, et joignant les pôles du grain.
Fixation et dégraissage préalables avec éthanol
à 95° (jusqu’à évaporation de la goutte) !
Prépa 1 : Safranine formolée de Sémichon, 10 minutes >
excellent résultat, pour une coloration de masse : rouge sang +/- foncé
Prépa 2 : Astra Blue, 2 minutes > résultat
très bon : bleu ciel remarquable
Prépa 3 : Violet de Gentiane, 5 minutes > excellent
résultat : violet intense
Prépa 4 : Vert de Méthyle, 5 minutes > superbe résultat
: l’ensemble intine-exine est remarquablement coloré en vert clair, et différencié nettement de
manière sélective, car le contenu du grain n’est pas coloré ; épaisseur de la paroi : 1,5 µm
Prépa 5 : Eosine aqueuse à 2 %, 5 minutes > pourpre
foncé très marqué
La Capucine : Tropaelum majus Linné :
grains de pollen (20/08/2003)
Forme triangulaire équilatérale ;
dimensions : 25-28 µm de côté, avec une ornementation finement ponctuée et les trois angles qu semblent
arrondis de manière concave.
Fixation et dégraissage préalables avec éthanol à 95° (jusqu’à
évaporation de la goutte ...2 x) !
Prépa 1 : Safranine formolée de Sémichon, 10 minutes >
excellent résultat, pour une coloration de masse : rouge cerise +/- foncé
Prépa 2 : Carmin aluné, 10 minutes > résultat valable
mais nombreux cristaux dans la préparation et halo désagréable autour des spores : rose clair
Prépa 3 : Carmin indigo, jusqu’à évaporation, >
résultat valable mais halo désagréable autour des spores, comme si elles s’étaient vidées de leur
contenu : jaune-roux clair
Prépa 4 : Vert de Méthyle, 5 minutes > superbe résultat
: la cuticule du grain est remarquablement colorée en vert clair, et différenciée nettement du
contenu qui est peu coloré ; épaisseur de la paroi : 0,5 à 0,75 µm
La Passiflore (fleur de la Passion) :
grains de pollen (26/08/2003)
Une difficulté apparaît après
dégraissage : les grains sont enrobés d'une gangue qui ne disparaît pas au 1er passage ; il s'avère
nécessaire d'effectuer plusieurs dégraissages successifs, afin de mettre en évidence une superbe ornementation
de l'exine. A voir absolument !
Dimensions : globes un peu écrasés vers une ébauche de triangle, de
52-558 µm de côté, avec 3 lignes en 1/2 lune.
F
dégraisser 5 fois de suite et contrôler au microscope :
inutile de colorer si l'ornementation n'est pas visible !
Prépa 1 : Safranine : 30 secondes MAXIMUM > revêtement
superbe
Prépa 2 : violet de Gentiane, 30 secondes > belle
coloration de masse
Prépa 3 : Vert de Méthyle acétique, 5 minutes > très bon
résultat
Prépa 3 : bleu de crésyl alcoolique, 2 minutes >
résultat banal
Remarque : le montage au Baume du Canada est meilleur et
plus facile à réaliser qu'à la Glycérine gélatinée : problème de bulles difficiles à faire
disparaître
Le tournesol : Helianthus annuus
Linné : grains de pollen globuleux (26/08/2003) ; dimensions : 26-28 mµ
dégraisser 2 fois de suite et contrôler au microscope :
inutile de colorer si l'ornementation n'est pas visible !
Prépa 1 : Safranine > excellent résultat en rose après
5 secondes de décoloration, rouge clair après 15 secondes, rouge pourpre après 20 secondes
Prépa 2 : Vert de Méthyle acétique, 5 minutes > résultat
superbe
Précisions :
Les manipulations destinées à la fixation et à la déshydratation,
avant et après coloration, et réalisées à l’éthanol à 95°, ne sont d’actualité que s’il s’agit de
monter au Baume du Canada, pour l’obtention de préparations à long terme (définitives).
S’il s’agit
de monter à la glycérine gélatinée, un seul bain d’alcool est nécessaire pour le dégraissage, car le
milieu de montage ne nécessite pas de déshydratation.
Le Paon du jour : Inachis io Linné
: (Lépidoptère Rhopalocère de la famille des Nymphalidae).
Il
nous semble inutile de capturer un papillon et de le tuer pour réaliser cette observation ! il vous
suffit de vous rendre dans un grenier et vous y trouverez immanquablement l’un ou l’autre spécimen de
papillon diurne ou nocturne, qui s’est fait piéger et y est mort.
Ecailles alaires (12/08/2003) ;
il faut savoir que Lépidoptère signifie « à ailes couvertes d’écailles ».
Dégraissage à l’éthanol : laisser évaporer 2 fois !
Montage au Baume du Canada
Aucune coloration n’est nécessaire !
Nous rencontrons principalement, chez cette espèce, deux sortes d’écailles :
des écailles étroites et allongées, de 120 x 20 µm,
généralement trifides
des écailles en forme de tuiles, diversement colorées (c’est
leur disposition qui donne la coloration générale et tellement variée des papillons), de 140-150 x
60 µm ; une extrémité est multifide (pointes arrondies variant de 3 à 8) ; l’autre est échancrée et
porte un pédicelle d’attache
toutes sont finement striées longitudinalement