ESSAI de synthèse des techniques à employer pour arriver à des préparations définitives de pièces traitées pour une coupe au microtome automatique.


Les règles générales et explications théoriques sont à rechercher dans nos fiches techniques publiées sur notre site, et sont basées sur les recherches et théories de DEFLANDRE, SEGUY, LANGERON & LOCQUIN…

Nos chaleureux remerciements sont adressés à G. FANNECHERE qui nous a fait découvrir le Poly Ethylène Glycol (PEG), à A. AYEL et J.L. JALLA qui nous ont révélé le PolyVinylic Alcool PVA), à Paul LEROY, pour ses longues et patientes explications relatives au montage de préparations définitives, surtout entomologiques, et au Dr. A. VANDERWEYEN qui nous a enseigné comment utiliser un microtome de laboratoire.

MODUS OPERANDI :
Nous avons travaillé sur des chapeaux de lactaires, en pratiquant des coupes transversales de manière à pouvoir mettre en évidence la trame des lames de l’hyménophore, (sujet difficile s’il en est), de même que les basides, pleurocystides et cheilocystides, éléments que nous avions posés comme objectifs obligatoires et incontournables de notre recherche, le TOUT visible dans une seule préparation ou figurent 8 à 15 lames !
Notre volonté d’utilisation d’un milieu d’inclusion à solvant aqueux se justifie par le fait que l’ inclusion à la paraffine exige une déshydratation totale par l’alcool, le trichloréthylène et le xylol, qui génèrent une déformation manifeste des structures fragiles de l’hyménophore (basides, cystides), et qui peuvent être néfastes pour la santé. Cela implique en outre un mode opératoire lourd et très long, à même de rebuter les plus courageux.
L’utilisation du PEG a sensiblement raccourci la procédure, même si cela demande encore du temps, de la patience et du courage ….


Travail en MILIEU AQUEUX, pour finaliser dans la glycérine gélatinée, le PVA (Alcool PolyVinylique), le lactochloral, le conservateur de Hoyer….


1. LA FIXATION


  1. Diviser l’objet à fixer en morceaux d’environ ½ à 1 cm³ (parallélépipèdes rectangles de 2 à 3 cm de long).
  2. Plonger dans le fixateur durant 24 heures : notre choix s’est porté sur le Bouin-Hollande et sur l’AFA (Alcool Formolé Acétique). La fixation peut se faire à l’étuve, à 37-40°, dans des flacons bouchés (genre flacons à prélèvements) ou des flacons de Borrel, et pourra être ramenée alors à 8 –12 heures…. Nous utilisons personnellement des éprouvettes bouchées, de 10 cc utiles.
  3. Laver 1 fois à l’eau distillée (dans une éprouvette, avec 5 à 10 cc par pièce à laver).
  4. Couper les pièces en fragments encore plus petits : cubes de 3 à 5 mm de côté.
  5. Les plonger à nouveau dans le fixateur choisi durant 24 heures.
  6. Laver 3 fois à l’eau distillée.
  7. Les pièces fixées seront soumises à la coloration le plus vite possible.
  8. Il faut savoir que les pièces soumises à l’inclusion peuvent se conserver quasi indéfiniment quand elles sont incluses dans le milieu choisi.

à gauche, les tubes de fixateur ; à droite, les tubes de colorant


2. LA COLORATION de masse


Les essais ont été réalisés avec les colorants suivants : bleu de méthyle acétique, orange de méthyle, violet de gentiane, safranine, vert de méthyle, carmin acétique ; au départ, le colorant est redilué 2 à 10 fois par rapport au flacon préparé.
  1. Plonger les pièces dans 5 à 8 cm³ de colorant dilué et les laisser séjourner 24 heures (dans une éprouvette bouchée).
  2. Rincer 3 fois de suite à l’eau distillée.
  3. Sécher passivement sur un papier absorbant.
  4. Les pièces fixées seront soumises à l’inclusion le plus vite possible.

à gauche, le matériel pour inclure ; à droite, les cubes prêts à la coupe, sortant des bacs à glaçons


3. L'INCLUSION


  1. Les pièces ont été rincées 3 fois dans l’eau distillée, puis égouttées.
  2. A partir d’ici, tout le travail s’effectue sur plaque chauffante !
    Nous utilisons à cet effet une plaque chauffante de laboratoire (qui a l'avantage d'être munie d'un thermostat), ou à défaut une plaque chauffante de cafetière électrique de 750 W).
  3. Faire fondre du PEG 4000 pur dans une coupelle en pyrex (on obtient un liquide complètement transparent) : le point de fusion est à 54-58° C.
  4. Y laisser les pièces durant 6 heures afin de permettre une bonne imprégnation.
  5. Faire fondre du PEG 20000 pur dans une autre coupelle en pyrex (le point de fusion est à 58-63° C.) et y placer les pièces durant 1 heure en les sortant directement de l’autre bain.
  6. IMPORTANT : la pince qui sert à passer d’un bain à l’autre doit être bien chaude également ; l’objet doit être bien immergé dans le liquide d’inclusion.
  7. Verser le PEG 20000 bien chaud dans un moule (les bacs à glaçon en PVC conviennent parfaitement) et y placer la pièce en prenant bien soin de l’orienter pour les futures coupes (c’est assez facile car le liquide est transparent à chaud).
  8. Refroidir le moule à l’air puis à l’eau (le PEG prend une coloration beige jaunâtre). ATTENTION ! très peu de temps en contact avec l’eau, qui est le solvant du PEG.
    Ces opérations (3 à 8) seront effectuées en 7 heures !
  9. Démouler et essuyer les blocs soigneusement.

à gauche, le microtome de Minot ; à droite, le cube d'inclusion, avec la pièce nettement visible


4. LA COUPE


Elle est effectuée à l’aide d’un microtome automatique du modèle MINOT.
  1. La lame du microtome doit être parfaitement aiguisée (c’est la condition première et essentielle de coupes régulières : il faut apporter un soin minutieux et extrême à l’aiguisage).
  2. préparer le bloc de PEG ou de paraffine :
    • Le tailler en forme de prisme de +/- 1 cm³, selon la taille du fragment inclus et déjà amincir autour de la pièce qui est visible dans le substrat).
    • Effectuer cette opération à l’aide d’une lame très coupante.
    • L’excédent de PEG ou de paraffine sera soigneusement récupéré pour être refondu et réutilisé.
    • Nous avons choisi, dans un premier temps, de conserver entière la surface d’appui du bloc brut, afin de garder une meilleure attache sur le support du microtome.
  3. Fixer le petit prisme obtenu sur le plateau du microtome, préalablement enduit de produit chauffé, pour faciliter l’adhérence ou directement chauffé à la flamme. ATTENTION ! Il faut apporter beaucoup de soin à cette opération de manière à ce que le bloc ne se détache pas lorsque le microtome fonctionne.
  4. Refroidir la pièce métallique à l’eau puis mettre le plateau support en place.
  5. Régler la molette d’épaisseur des coupes.
  6. Effectuer les coupes (ne pas aller trop vite pour tourner la manivelle : une coupe par seconde au grand maximum…).
  7. ATTENTION : le rasoir (la lame) doit toujours rester très propre ! Nettoyer chaque fois que c’est nécessaire à l’eau !
  8. Les coupes s’enroulent sur elles-mêmes comme des feuilles de papier à cigarettes ! Les plonger telles quelles dans une coupelle d’eau distillée glycérinée à 0,1 %, et elles se déroulent naturellement tandis que le PEG fond.

5. LE COLLAGE


  1. Sortir la coupe et l’étaler sur une lame porte-objet dans une nouvelle goutte d’eau glycérinée (travailler avec une aiguille entomologique très fine (ou une aiguille d’acupuncture) et au binoculaire si ce sont des pièces délicates : ici pour mettre en place les lames du champignon.
  2. Laisser évaporer quasi complètement, mais en gardant la coupe humide, sinon on verra apparaître des bulles d’air dans la préparation (surtout, ne pas chauffer).

6. La COLORATION des coupes


Utiliser à cet effet des cuvettes à coloration si on travaille sur plusieurs lames à la fois (dans ce cas précis, les coupes doivent être bien collées, sinon elles risquent de se détacher du support), ou déposer une goutte de colorant sur la lame.
Travailler de préférence avec des colorants aqueux !
  1. Si on estime qu’il ne faut pas recolorer, passer directement au montage.
  2. S’il nous apparaît intéressant de recolorer au rouge Congo SDS, au bleu de crésyl ou au bleu coton lactophénol, poser directement une goutte sur la lame de verre.
  3. Rincer à l’eau.
  4. Eliminer avec un papier absorbant l’essentiel de l’eau, sans toucher la coupe.

à gauche, la lame couvre-objet ronde ; au centre, la coupe transversale des lames de l'hyménophore ; à droite, la préparation terminée (nous utilisons des lames avec une partie colorée directement inscriptible)


7. Le MONTAGE de la préparation


Dans un milieu aqueux, on va parler de « préparations semi- définitives » qui vont durer quelques années, 3 - 5 – 10 – 15 ans, selon le milieu utilisé.
  • Travailler avec des lames couvre-objet rondes.
  • Si ce sont des coupes qui ne nécessiteront pas d’observation à des grossissements importants, on peut poser la lame simplement.
  • Sinon, il est nécessaire d’utiliser un moyen de pression pour bien aplatir le tout (pince à linge par exemple).
  • La taille de la goutte du milieu d’inclusion est très importante : il faut qu’il y ait le moins de débordement possible.
  • Sinon, il est impératif de nettoyer ! (seules l’expérience et la pratique répétées permettent d’arriver au bon dosage).
  1. Poser la goutte bien dosée du milieu choisi (conservateur de Hoyer, PVA lactophénolé, glycérine gélatinée, lactochloral) sur la coupe.
  2. Poser la lame couvre-objet de biais afin d’éviter la formation de bulles.
  3. Placer l’instrument de pression choisi et le laisser durant 2 à 3 heures.
  4. Eliminer le liquide de débordement à l’eau (sauf pour le PVA ou le Hoyer : il servira de lutage).
  5. Luter au vernis à ongles, si nécessaire…
  6. Placer les étiquettes : y indiquer la numérotation dans la boîte de rangement, le nom de la pièce, le colorant utilisé, la référence vers un carnet de notes … C’est très important, sinon la préparation n’aura aucune valeur scientifique ! Ecriture à l’encre indélébile…
  7. Vernir les étiquettes au vernis à ongles transparent de manière à pouvoir nettoyer la lame chaque fois qu’elle est utilisée, et sans dommage pour les étiquettes.